Anal Chem|兩親性適配體電極原位檢測單細胞中的ATP
發布時間：2024-07-24
作者：江蘇瑞明生物科技有限公司
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內容概要：
近日，湖北大學化學化工學院在Anal Chem雜志發表了題為“In Situ Measurement of ATP in Single Cells by an Amphiphilic Aptamer-Assisted Electrochemical Nano-Biosensor”論文，采用兩親適配體修飾的納米電極實現了單細胞水平的ATP原位檢測。
(A) 兩親性適配體的圖示和及(B) 在細胞核、細胞質和細胞外空間中原位檢測 ATP。
單個活細胞中 ATP的原位和定量檢測對于理解疾病的生理和病理過程非常必要，然而，ATP 很難在單細胞中檢測到，因為它是非電活性的，而且含量低。超微電極由于其體積小和靈敏度高的特征，可用于單細胞分析，而適配體是一類特異性結合靶分子的單鏈寡核苷酸，由于其操作簡單、免疫原性低、成本低，已成為一種強大的靶向配體。本研究介紹了一種基于兩親適配體輔助碳纖維納米電極 (aptCFNE) 的電化學納米生物傳感器，具有高信噪比。該電極通過實時單細胞多模態分析儀可以快速、選擇性地檢測單個 HeLa 細胞的細胞核、細胞質和細胞外間隙中的 ATP 含量，本研究在還記錄了單細胞水平上的抗癌藥物治療效果，這對于理解ATP相關的生物學過程和藥物篩選具有重要意義。
圖 1. (A) 制備好的 CFNE 示意圖。 (B) 所準備的 CFNE 尖端的掃描電子顯微圖像。插圖：相應的尖端視圖。 (C) CFNE 尖端碳纖維的直徑分布。 (D) 實時單細胞多模態分析儀的拍攝照片。 (E) 放大的照片顯示用于固定和移動納米電極的支架和用于電化學檢測的三電極系統。 (F) 在含有 2 mM Fc-CH2OH 的 PBS (pH 7.4) 中以裸 CFNE 獲得的典型 CV。掃描速率，50 mV s?1
為了獲得更好的細胞內檢測性能，本研究對系統的反應條件進行了優化，包括適配體濃度和 ATP 反應時間。選擇 1 μM 作為最佳適配體濃度，aptCFNE 可以在 1 分鐘內響應 ATP，然后在 5 分鐘時達到一個平臺。aptCFNE 對水溶液中 ATP 濃度的 DPV 響應（圖2C）結果表明，納米電極之間的微小差異滿足了平行實驗的要求。圖 3D在ΔI/I0和ATP濃度之間表現出良好的線性關系，確保了納米生物傳感器對ATP傳感的優異靈敏度。通過分別與 ATP 類似物（例如 GTP、CTP、UTP 和 ADP）、葡萄糖 (glu) 和細胞培養基反應，進一步研究了 aptCFNE 的選擇性。該納米傳感器表現出良好的選擇性和靈敏度，使其能夠識別復雜系統中的 ATP。
圖 2. (A) 適配體濃度和 (B) 納米電極孵育時間對 ΔI/I0的影響（增加峰值電流 ΔI = In? I0）和 0.25 mM ATP。(C) aptCFNE 在 10 mM PBS (pH 7.4) 中的兩組 DPV 響應包含不同的 ATP 濃度，范圍從 0、0.05、0.25、0.50、0.75、1.0、1.5 到 2.0 mM (a-h)。(D) ΔI/I0和 ATP 濃度之間的線性關系。(E) aptCFNEs 對 1.0 mM ATP、5.0 mM ATP 類似物（GTP、CTP、UTP 和 ADP）、25 mM 葡萄糖和細胞培養基的選擇性。(F) aptCFNE 和 CFNE 對在 PBS (pH 7.4) 中連續添加 ATP（1、3、6 和 10 mM）的安培電流響應。
在亞細胞水平上原位檢測 ATP 對于分析疾病特異性基因表達和細胞異質性具有重要意義。在實時單細胞多模態分析儀的輔助下，這種納米傳感器被精確地移動到亞細胞水平的單個 HeLa 細胞中，并以良好的空間分辨率進行了電化學分析（圖1D、E）。本實驗中，使用熒光染料（Calcein-AM 和 PI）對 HeLa 細胞進行染色并研究其活力。在從單個細胞中插入和去除 aptCFNE 后，細胞的熒光圖像保持不變，證實單個細胞仍然存活（圖 3B) 。將納米傳感器在 ATP 內的細胞培養基中孵育 5 分鐘，并進行檢測，如圖所示圖 3C，隨著 ATP 濃度從 0.05 增加到 5 mM，信號響應逐漸增加，跨越 2 個數量級。圖 2D 顯示 ΔI/I0和 ATP 濃度之間具有良好的線性關系，檢出限為4.5 μM (S/N =3)，可用于單細胞水平ATP的檢測。
圖 3. (A) 實時單細胞多模態分析儀控制 aptCFNE 進入 (a) 細胞核、(b) 細胞質和 (c) 細胞外空間的明場顯微鏡圖像。 (B) 用 Calcein-AM 染色的 HeLa 細胞的代表性明場和熒光圖像。比例尺：20 微米。 (C) aptCFNEs 在細胞培養基中的 DPV 響應包含不同的 ATP 濃度，范圍從 0 到 0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.75、1、2、3、4 和 5 mM (a-m)。 (D) ΔI/I0和 ATP 濃度之間的相應校準圖。(E) 插入不同區域后 aptCFNEs 當前響應的直方圖。(F) 計算的 15 個單獨 HeLa 細胞的 ATP 濃度的箱形圖。
細胞內ATP的變化與許多疾病和病理密切相關，研究外部藥物刺激對細胞狀態的影響非常重要。最后，所制備的電化學納米生物傳感器被用于抗癌藥物（依托泊苷和寡霉素）對ATP增加和減少的實驗。研究發現，依托泊苷可以增加細胞內 ATP 含量。這和報道的依托泊苷的作用機制相一致，包括抑制核苷轉移和DNA、RNA、蛋白質的合成，并能促進ATP的合成。而寡霉素的功能是通過抑制氧化磷酸化來減少 ATP 合成，細胞核、細胞質和細胞外空間的峰值電流分別從 0.059 降低到 0.047 nA，從 0.053 降低到 0.038 nA，從 0.046 降低到 0.032 nA。這些結果對于理解單細胞相關的生理過程和藥物篩選具有重要意義。
圖 4. 9 個單獨的 HeLa 細胞在用（A） 100 μM 依托泊苷處理 20 分鐘和 (C) 3 μg/mL 寡霉素處理 3 小時后在 (a) 細胞核、(b) 細胞質和 (c) 的亞細胞位置的峰值電流細胞外空間。 (B, D) 用依托泊苷和寡霉素處理后用 Calcein-AM 染色的活 HeLa 細胞的熒光圖像。比例尺：20 微米。
In Situ Measurement of ATP in Single Cells by an Amphiphilic Aptamer-Assisted Electrochemical Nano-Biosensor
Min Jiang, Xiaoxue Xi, Zhen Wu,* Xiuhua Zhang, Shengfu Wang, and Wei Wen*Cite This: Anal. Chem. 2022, 94, 14699?14706
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