湖北大學王升富、文為教授課題組在《Applied Materials & Interface》期刊發表最新研究成果：“Endogenous Protease-Activatable Nanosensor Based on PNA?Peptide?DNA Engineering for AND-Gated and Dual-Model Detection of MicroRNA in Single Living Tumor Cells ” ，研究組提出了一種由肽核酸-肽- DNA共聚物引導的內源性蛋白酶激活納米傳感器(PA-NS)，代替外源性引發劑在體外原位檢測低含量的癌癥生物標志物，通過實時單細胞多模態分析技術，結合電化學檢測和光學成像研究PA-NS在活腫瘤細胞中對miRNA-21 (miR-21)的光電雙模型檢測。

圖1.雙模態響應的PA-NS在單個活腫瘤細胞中腫瘤特異性檢測miR-21的示意圖

要點1 PA-NS對miR-21體外光學傳感的評價

圖2.(a) PA-NS雙模態檢測miR-21示意圖。(b)在CaB激活或未激活的情況下，PA-NS對不同濃度miR-21反應的熒光強度。(c) PA-NS與miR-21和CaB單獨或聯合孵育的熒光強度。(d) PA-NS檢測miR-21的邏輯運算真值表(添加和不添加miR-21或CaB分別定義為“1”和“0”)(e)不同濃度的PA-NS電化學檢測miR-21的I?V特性(插圖為I?log C的校準曲線)

要點2單細胞水平上研究PANS探針的腫瘤特異性活性

研究組以腫瘤細胞為實驗組，健康細胞為對照組。如圖3b所示，利用CaB蛋白酶在腫瘤細胞中選擇性激活PA-NS系統，隨后通過與miR-21的位移反應誘導FAM熒光團的釋放。如圖3c所示，監測到活化的PA-NS探針在活腫瘤細胞中有明顯的FAM熒光響應;PA-NS探針的成功激活可歸因于腫瘤細胞中CaB蛋白酶的過表達，HeLa細胞中miR-21的高水平進一步觸發位移反應。相比之下，由于CaB蛋白酶的低表達，PA-NS探針在健康細胞中被“鎖定”(圖3d)，表明PA-NS探針在健康細胞中不能被激活。如圖3e所示，PA-NS釋放的FAM的熒光響應幾乎可以忽略不計，這表明PA-NS具有優異的腫瘤特異性活性，在臨床癌癥診斷和治療方面可能具有相當大的應用潛力。
      隨后，用微光纖(~ 10 μm)收集單個活腫瘤和健康細胞的熒光信號，進一步證明了腫瘤特異性活性。首先，將PA-NS轉染到腫瘤細胞中，再孵育3.5 h，激活探針并釋放FAM熒光信號。然后，利用三軸微操作系統將微光纖精確地附著在細胞膜上。在微光纖的輔助下，將495nm的激發光引導至單個活細胞，激活FAM熒光信號。如圖3f所示，微光纖輻照后細胞形態和細胞活力幾乎不受影響，說明微光纖對細胞活性的影響可以忽略不計。然后用光電倍增管(PMT)收集并記錄單個活細胞的熒光信號。利用微光纖分別監測單個腫瘤細胞和健康細胞釋放的FAM信號。如圖3g所示，通過PMT獲取6個單個腫瘤細胞和健康細胞釋放的FAM熒光信號，并用微光纖進行定量分析。我們看到腫瘤細胞釋放的熒光強度遠高于健康細胞，證實PA-NS在腫瘤細胞中可以被特異性激活，在健康細胞中處于“停止”狀態。考慮到細胞的異質性，從20個單個活腫瘤細胞和健康細胞中收集相應的統計結果，揭示了熒光強度的變化。如圖3h所示，在單細胞水平上，腫瘤細胞的熒光強度值比健康細胞高約3.4倍，比空白組高約5.1倍，這與熒光成像結果吻合良好。此外，健康細胞的熒光強度比空白組高~ 1.55倍，表明PA-NS具有令人滿意的腫瘤特異性活性和對腫瘤細胞的低背景信號。

圖3.(a)用Lip3000轉染PA-NS的過程。(b) PA-NS在腫瘤細胞中的活化過程。(d) PA-NS在健康細胞中的反應。高分辨率熒光顯微鏡圖像顯示PA-NS對腫瘤細胞(HeLa細胞)(c)和健康細胞(HUVEC細胞)(e)的反應。(f)高分辨率熒光顯微鏡圖像顯示靠近細胞的微光纖:(i)無激發的亮場;(ii)在約490 nm處激發;(iii)與赫斯特病毒孵育;(四)合并圖像。(g)利用微光纖檢測PA-NS在單個活腫瘤細胞和健康細胞中的熒光響應。(h)利用微光纖，PA-NS對單個活腫瘤細胞和健康細胞的對應熒光強度(490nm)箱形圖。標尺:20 μm。

要點3 miR-21在單個活細胞中的原位光學定性和電化學定量分析

為了驗證在單個活細胞中同時進行光學和電化學檢測miR-21的可行性，首先，評估了用電極插入細胞并同時用微光纖將其連接到同一細胞上的操作可行性。如圖4a所示，在雙邊三軸微操作系統的幫助下，納米電極和微光纖被引導并移動到同一個單細胞中。用微光纖監測了單個腫瘤細胞60s內熒光強度的變化。如圖4b所示，觀察到一個“signal-on”熒光信號，熒光強度在60s內趨于穩定，說明FAM熒光信號具有良好的穩定性和低背景信號。考慮到細胞的異質性，收集并測量了幾種腫瘤細胞的熒光強度。如圖4c所示，腫瘤細胞的熒光響應比空白組高~ 5倍，證明PA-NS可以在腫瘤細胞中被激活，并借助微光纖實現單細胞水平的光學分析。接下來，評估了用修飾的Au NE在單個活細胞中電化學檢測miR-21的可行性。如圖4d所示，通過三軸微操作系統控制和引導修飾后的Au NE附著在細胞上，然后通過倒置顯微鏡上安裝的微操作器調節納米電極并插入細胞(圖4e)。考慮到細胞的異質性，對15個單個活腫瘤細胞收集并分析相應的統計結果。如圖4f所示，納米電極與腫瘤細胞孵育后，電化學信號下降了約40% (***P < 0.001;平均值±SD = 1.00±0.09 vs 0.62±0.09)，表明PA-NS涉及雙模型信號輸出平臺，可以檢測單個活腫瘤細胞中的miR-21。

圖4.(a)顯示插入單細胞的納米電極和用于單細胞光子數收集的光源引導的微光纖的顯微圖像。(b)微光纖采集的腫瘤細胞熒光強度。(c)使用微光纖對單個腫瘤細胞的熒光強度進行相應的直方圖統計。納米電極在細胞外(d)和插入細胞內(e)。(f) 15個單個活腫瘤細胞對應的電流框圖。標尺:20 μm。

實時單細胞多模態分析儀 

瑞明生物實時單細胞多模態分析儀主要性能

1、實時單細胞多指標檢測：實時檢測單個活細胞內小分子含量（如葡萄糖、乳酸、ATP、膽固醇、Ca²⁺、K⁺等）及酶活性（葡萄糖苷酶、鞘磷脂酶、乳酸脫氫酶等），可匹配160余種商品化試劑盒；

2、實時亞細胞原位檢測：在亞細胞水平（胞質、胞核、胞膜）實現實時連續、原位檢測；

3、超微量提取、注射：單細胞水平提取細胞器（如溶酶體、線粒體）、胞質進行質譜或其它平臺的聯用分析；單細胞注射藥物、代謝劑等，并進行藥效或機制評價；

4、活體水平檢測：活體水平實時檢測生化指標（用藥前后、中醫藥針灸刺激前后）的變化。

Endogenous Protease-Activatable Nanosensor Based on PNA–Peptide–DNA Engineering for AND-Gated and Dual-Model Detection of MicroRNA in Single Living Tumor Cells

Xiaoxue Xi, Zhen Wu, Xiuhua Zhang, Yuebin Li, Yuandi Zhao, Wei Wen, and Shengfu Wang

ACS Applied Materials & Interfaces 2023 15 (18), 21917-21928

DOI: 10.1021/acsami.3c02012